T2噬菌体侵染细菌的实验如何标记的问题 (2017-02-19 22:15:24)

我是夏雯静

教材研究：“T2噬菌体侵染细菌的实验”是一个用来证明DNA是遗传物质的经典实验。教学中经常会强调标记的程序，即先培养细菌，再培养噬菌体，得到标记的噬菌体，再去感染普通的大肠杆菌。但培养细菌的原料又是什么呢？是不是就是作业本上讲的“32P标记的脱氧核苷酸”？
查找了资料，梁红主编的《遗传学》第112页，将大肠杆菌分别培养在含有35S硫酸盐和含有32P磷酸盐的培养基中。而不是所谓的脱氧核苷酸。
同样的内容，在研究DNA复制时用到的细胞培养原料是15NH4Cl。
附：T2噬菌体侵染大肠杆菌的实验（陈卫东老师发表在《中学生物学》上的文章）
1952年，赫尔希和蔡斯以T2噬菌体为实验材料，利用放射性同位素标记的技术，完成了T2噬菌体侵染大肠杆菌的实验。这个实验对证明DNA是遗传物质的结论更具说服力，因为其将噬菌体的DNA和蛋白质完全分开，因此可以完全独立地体现DNA在遗传中的作用。
首先将标记35S或32P的噬菌体分别侵染培养液中未被标记的大肠杆菌，待T2噬菌体将其DNA注入寄主细胞后通过搅拌使遗留的蛋白质壳从寄主细胞壁上脱离下来；采用低速离心，使受侵染的细胞沉淀而噬菌体的空壳体留在上清液中。用含32P和35S放射性同位素分别标记噬菌体DNA和蛋白质的测定结果发现，大部分32P出现在细胞沉淀物内，而绝大多部分35S则显示在上清液中，说明T2噬菌体侵染大肠杆菌是DNA进入寄主细胞中，而蛋白质壳体则留在细胞外面。由于新产生的子代噬菌体是在原噬菌体的DNA控制下合成的，因而说明DNA是噬菌体的遗传物质。
　　（1）实验原理：T2噬菌体是一种专门寄生在大肠杆菌体内的病毒，其组成大约是60%的蛋白质和40%的DNA。蛋白质构成它的外壳，而DNA藏在它的头部中。T2噬菌体侵染大肠杆菌后，就会在自身遗传物质的作用下，利用大肠杆菌体内的物质来合成自身的组成成分，进行大量增殖。当噬菌体增殖到一定数量后，大肠杆菌裂解，放出来几十个至几百个噬菌体。T2噬菌体侵染大肠杆菌主要分为：感染阶段（含吸附和注入噬菌体DNA两步）、增值阶段（含噬菌体DNA的复制和蛋白质的合成、组装两个步骤）、成熟阶段（子代噬菌体的释放）。赫尔希和蔡斯的实验就是为了证明感染阶段中，究竟是噬菌体的DNA还是蛋白质进入了大肠杆菌，最终控制合成新的子代噬菌体的。
　　（2）如何标记T2噬菌体？由于病毒必须寄生在活体细胞中才能扩增，因此无法将T2噬菌体直接放在培养基中培养。赫尔希和蔡斯首先在分别含有放射性同位素35S和放射性同位素32P的培养基中培养大肠杆菌，再用上述被标记的大肠杆菌培养T2噬菌体，得到含有被32P标记DNA或被35S标记蛋白质的噬菌体。
　　（3）该实验离心之前为什么要搅拌？在离心之前，充分搅拌的目的是让T2噬菌体的蛋白质外壳与大肠杆菌的细胞体充分分离，如搅拌不够充分，则会出现较大的误差。尤其是用35S标记的蛋白质外壳的实验中，如搅拌不够充分，离心后T2噬菌体的蛋白质外壳将会随着大肠杆菌沉下去，沉淀物中将会出现较多的放射性，无法说明蛋白质没有进入大肠杆菌。
　　（4）离心的结果是什么？由于T2噬菌体与大肠杆菌的比重不同，离心后，大肠杆菌及其内所含有的物质（如噬菌体注入其中的DNA）会沉淀到下方，而未侵染的噬菌体或侵染后提前释放的噬菌体及侵染后留在大肠杆菌外侧的噬菌体蛋白质外壳从细菌上分离后会留在上清液中。
　　（5）离心的目的是什么？35S标记蛋白质外壳的T2噬菌体，离心后，如发现沉淀中几乎没有放射性，而上清液（含噬菌体外壳，可能还有少量新生成的噬菌体及未侵染的噬菌体）中则有较高的放射性，说明留在大肠杆菌细胞外面的是蛋白质；32P标记DNA的T2噬菌体，发现沉淀中有很高放射性，而上清液中几乎没有放射性，则T2噬菌体的DNA进入了大肠杆菌细胞。
　　（6）离心后为什么会出现一些误差？在噬菌体侵染细菌的实验中，赫尔希和蔡斯分别用35S和32P标记的T2噬菌体侵染大肠杆菌，理论上，用35S标记的T2噬菌体侵染大肠杆菌后，上清液具有很高的放射性，下层沉淀物中应该不含放射性。用32P标记的噬菌体侵染大肠杆菌后，上清液中不含放射性，下层沉淀物中具有很高的放射性。而实际上，实验的最终结果显示：用35S标记的T2噬菌体侵染大肠杆菌后，在离心的下层沉淀物中，具有一定的放射性，而上清液中的放射性强度比理论值略低。用32P标记的T2噬菌体侵染大肠杆菌后，在离心的上层清液中，具有一定的放射性，而下层沉淀物中的放射性强度比理论值略低。为什么会出现这种情况呢？在实验中，35S标记的T2噬菌体与大肠杆菌混合培养后，如在搅拌器中搅拌不充分，使吸附在大肠杆菌外被35S标记的噬菌体蛋白质外壳没有与大肠杆菌完全分离开，离心后下层沉淀物中就会存在放射性，而上清液中的放射性比理论值略低。32P标记的T2噬菌体与大肠杆菌混合培养后，充分搅拌后离心，可能有一些噬菌体没有能够侵染大肠杆菌，经离心后少量分布于上清液中，使上清液出现放射性，而下层沉淀物中的放射性强度比理论值略低。或实验中，32P标记的噬菌体和大肠杆菌混合培养的时间过长，噬菌体在大肠杆菌细胞内增殖后释放出来，经离心后分布于上清液，使上清液出现放射性，而下层的放射性强度比理论值略低。因此用32P标记的噬菌体侵染实验中，要严格控制好从噬菌体和大肠杆菌混合培养到用离心机分离的时间，时间过短未充分侵染；时间过长，则侵染进入大肠杆菌细胞内的噬菌体增殖产生的子代噬菌体释放出来了，都会使实验误差增大，故严格控制好时间是减小此实验误差的关键因素之一。
　　（7）此实验能否说明蛋白质不是遗传物质？在此实验中，由于只有DNA进入了大肠杆菌，而蛋白质外壳没有进入大肠杆菌，因此子代噬菌体是在T2噬菌体的DNA的控制下合成的，能够说明DNA是遗传物质。由于蛋白质外壳并没有进入大肠杆菌细胞内，因此子代噬菌体虽然不是由T2噬菌体的蛋白质控制合成的，但也并不能说明蛋白质就没有控制遗传的能力，因此仅凭此实验并不能说明蛋白质就不是遗传物质。
　　衍伸的问题：
　　（1）如用少数35S标记的噬菌体侵染未被标记的大肠杆菌，释放的子代噬菌体中理论上讲应该有多少噬菌体中含有35S？如改用少数32P标记的噬菌体侵染未被标记的大肠杆菌，释放的子代噬菌体中理论上讲应该有多少噬菌体中含有32P？
　　第一个问题比较简单，由于35S标记的是噬菌体的蛋白质外壳，蛋白质外壳无法进入大肠杆菌，控制合成子代噬菌体使用的原料全部来自未被标记的大肠杆菌，加上原来噬菌体的DNA又不含35S，因此形成的子代噬菌体全部不含35S。对于第二个问题，由于原来被32P标记的噬菌体要将自己的含32P的DNA注入大肠杆菌，并将以含32P的DNA为模板复制形成新的DNA，由于DNA的复制遵循半保留复制，因此复制的结果是子代噬菌体中理论上有亲代噬菌体数的二倍的子代噬菌体（其中均保留一条亲代噬菌体DNA的一条链）含有32P，其余的噬菌体均不含32P。
　　（2）如用未标记的噬菌体去侵染被32P或35S标记的大肠杆菌，子代噬菌体含放射性同位素的情况如何？
　　由于噬菌体未被标记，其侵染到大肠杆菌体内，合成子代噬菌体的原料全部来自大肠杆菌，因此子代噬菌体中全部含有35S。DNA虽然为半保留复制，但也只有少数子代噬菌体（相当于亲代噬菌体的二倍）的DNA双链中一条单链含亲代噬菌体的31P母链，另一条单链则含有32P，其余子代噬菌体的DNA的两条单链都只含32P，因此也是所有子代噬菌体中均含有32P。